Омикс-биомаркеры и ранняя диагностика: когда счастье возможно

Одна из важных целей омикс-технологий (в том числе транскриптомики, протеомики, метаболомики) в медицине — это поиск биомаркеров для диагностики распространенных неинфекционных заболеваний, в основном злокачественных опухолей. Часто говорят о ранней диагностике, то есть о тех случаях, когда болезнь выявляют впервые и на ранней стадии. Но всегда ли имеет смысл использовать молекулярные технологии для поиска ранних маркеров? Я хочу поговорить о том, какие параметры характеризуют молекулярные биомаркеры и их сочетания, для каких случаев их следует разрабатывать, а также рассказать о десятилетии развития постгеномных технологий в медицине и о собственном опыте в протеомике рака. Этот материал адресован в основном биологам и физикам, которые занимаются омикс-технологиями, но не всегда вдаются в медицинские подробности. Он поможет им избежать бесполезной работы с точки зрения постановки клинической задачи.

Одна из главных целей постгеномных, или омиксных, технологий в медицине — разработка биомаркеров для диагностики заболеваний [1]. Под постгеномными технологиями обычно подразумевают высокопроизводительное измерение продуктов генной экспрессии — транскриптомику и протеомику [2]. Косвенными продуктами генной экспрессии считают метаболиты, и их анализ — метаболомику — тоже часто причисляют к постгеномным методам, хотя, строго говоря, в составе метаболитов человеческого организма немало ксенобиотиков, которые к работе генома прямого отношения не имеют [3].

«Биомолекула» уже рассказывала, что такое омиксные технологии и как «большие данные» преобразили биологию сегодняшнего и завтрашнего дня: «„Омики“ — эпоха большой биологии» [4].

С другой стороны, возникает вопрос, что же такое биомаркеры, хотя это слово на слуху, и его значение понятно интуитивно. Биомаркер — измеряемый параметр, качественная или количественная характеристика которого свидетельствует о наличии или отсутствии какого-то заболевания или состояния. В широком смысле даже синяк под глазом может быть биомаркером. В клинической медицине такие биомаркеры называют симптомами. А вот в биохимии фигурируют другие, молекулярные биомаркеры, то есть измеряемые разными способами молекулы. И молекулы эти могут быть самыми разными — от простых ионов до высокомолекулярных белков, например антител к разным антигенам [5].

Технологии идентификации различных биомолекул в высокопроизводительном режиме стремительно прогрессируют [2], [6–10]. Совершенствуются и усложняются вычислительные методы обработки «больших данных» [11]. Тем не менее технологический прогресс не отменяет важности баланса омиксных методов и подготовительной клинической работы.

Существенная часть исследований использует в качестве групп сравнения пациентов с заболеваниями (например, со злокачественной опухолью), а в качестве контроля — практически здоровых людей или людей с хроническими патологиями, не имеющими отношения к интересующему заболеванию (в нашем случае — к раку). Иными словами, с помощью омикс-технологий разрабатывают тесты для ранней диагностики — чтобы как можно раньше отличить больных от здоровых, обнаружить заболевание на его ранней стадии [12]. Но всегда ли актуально это сравнение? Какими же свойствами должен обладать биомаркер, чтобы его целесообразно было использовать для ранней первичной диагностики, то есть когда болезнь выявляют впервые?

Я обратил внимание на эту проблему во время работы над грантовыми заявками по фундаментальной медицине [13]. В попытке разработать новые диагностические тесты их авторы часто предлагали сравнивать образцы от пациентов с разными стадиями злокачественных опухолей с пробами от относительно здоровых людей. При этом методы, которыми располагали исследователи, явно плохо соотносились с идеей скрининга — масштабного обследования большого количества здоровых людей для выявления относительно редкого заболевания. Ведь даже самые распространенные злокачественные опухоли, как мы увидим далее, остаются относительно редким явлением.

Фармакологические свойства препарата Омикс

Тамсулозин избирательно и конкурентно блокирует постсинаптические α1А-адренорецепторы, находящиеся в гладких мышцах предстательной железы, шейке мочевого пузыря и простатической части уретры. Снижает тонус гладких мышц предстательной железы, шейки мочевого пузыря и простатической части уретры, улучшая отток мочи. Одновременно уменьшается выраженность симптомов обструкции и раздражения, связанных с доброкачественной гипертрофией предстательной железы. Терапевтический эффект развивается через 2 нед после начала лечения. Тропизм к α1А-адренорецепторам, расположенным в мочевом пузыре, в 20 раз превосходит его способность взаимодействовать с α1В-адренорецепторами, расположенными в гладких мышцах сосудов. Благодаря высокой селективности не вызывает клинически значимого снижения системного АД как у пациентов с АГ (артериальная гипертензия), так и у пациентов с нормальным исходным АД. После приема внутрь быстро и полностью всасывается в ЖКТ. Биодоступность составляет около 100%. После однократного приема внутрь 400 мкг максимальная концентрация действующего вещества в плазме крови достигается через 6 ч. В равновесном состоянии (через 5 дней после курсового приема) значения максимальной концентрации активного вещества в плазме крови на 60–70% выше, чем после однократного приема препарата. Степень связывания с белками плазмы крови — около 99%. Тамсулозин не подвергается эффекту первичного прохождения через печень и медленно биотрансформируется в печени с образованием фармакологически активных метаболитов, сохраняющих высокую селективность к α1А-адренорецепторам. Большая часть активного вещества содержится в крови в неизмененном виде. Выводится с мочой, 9% дозы выделяется в неизмененном виде. Tамсулозина при однократном приеме — 10 ч, конечный T — 22 ч.

Что нужно, чтобы тест подходил для ранней диагностики

Не пересказывая учебники, напомню читателю о широко используемых параметрах диагностических тестов — точности, чувствительности и специфичности (см. врезку). Еще одним важным параметром, характеризующим новый тест, служит диагностическая ценность положительного результата (ДЦПР, PPV, positive predictive value) [14]. Она представляет собой отношение числа истинно положительных результатов (когда болезнь найдена верно) к сумме всех положительных результатов, истинных и ложных:

где ДЦПР — диагностическая ценность положительного результата, ИП — число истинно положительных результатов, ЛП — число ложноположительных результатов диагностики.

ДЦПР помогает оценить целесообразность использования теста для повального обследования какой-либо группы людей, то есть скрининга. Ее низкие значения могут сделать диагностический метод затратным и даже небезопасным с точки зрения общей выгоды для обследуемых. Но на этом остановимся чуть ниже.

Диагностические параметры биомаркера

Вновь разрабатываемый диагностический метод должен превосходить все уже существующие, а для этого его нужно сравнить с «золотым стандартом» — наилучшим методом, дающим (почти) безошибочный ответ (рис. 1). Однако, если существует золотой стандарт, зачем тогда новый тест? А затем, например, что он может быть более выгодным клинически или позволяет решать задачу быстрее, проще и дешевле. Так, если золотой стандарт — это инвазивное исследование во время операции или вообще post mortem, его диагностическая значимость, увы, невелика.

Рисунок 1. Как оценить работу диагностического теста? Что, если он сработал неправильно, назвав здорового больным или наоборот? Для этого нам надо знать, что происходит на самом деле. В этом поможет тест, который очень надежен, — «золотой стандарт». Сравнивая новые результаты с этим стандартом, мы можем подсчитать ошибки и решить, есть ли перспектива у нашего метода диагностики.

иллюстрация Алены Беляковой

Основными характеристиками нового теста служат его диагностическая точность, чувствительность и специфичность. Точность — это доля правильно диагностированных случаев среди всех обследованных, как больных, так и здоровых. Чувствительность — доля правильно диагностированных больных людей, а специфичность — здоровых.

Можно догадаться, что чувствительность и специфичность, в отличие от точности, зависят от порогового значения биомаркера или сочетания маркеров. Пороговое значение — это, например, концентрация молекулы в крови, при обнаружении которой (или более высоких значений) мы считаем человека больным. В случае комбинации маркеров такой порог будет более сложной функцией, учитывающей значения нескольких параметров. Если мы сильно снизим порог измеряемой концентрации биомаркера, то обнаружим всех больных (чувствительность 100%), но при этом поставим неправильный диагноз большему количеству не страдающих от заболевания испытуемых. Таким образом, при описании биомаркеров приводить их чувствительность и специфичность по отдельности не имеет смысла.

Представим ситуацию, когда гипотетический омикс-тест (этим термином для краткости обозначим тест, разработанный при помощи геномных и постгеномных технологий) показал выдающиеся результаты и отличает пациентов от условно здоровых людей с чувствительностью и специфичностью 98%. Предположим, что речь идет о распространенной злокачественной опухоли с частотой возникновения в популяции 100 случаев на 100 000 населения: эти числа справедливы, например, для рака предстательной железы в странах-лидерах по заболеваемости им [15]. Подвергнем скринингу эти 100 000 человек. При чувствительности 98% из 100 действительно больных 98 будут правильно диагностированы и лишь двое окажутся пропущенными. При специфичности 98% из 99 900 здоровых людей, которых мы обследуем, диагноз «рак» будет ошибочно поставлен 2%, то есть 1998 из числа обследуемых. Легко рассчитать, что ДЦПР в этом случае составит всего 4,6%, а почти 2 000 человек получат моральный ущерб, и им будет назначено дорогостоящее и, возможно, травматичное обследование (рис. 2). Заметим, что 98-процентные чувствительность и специфичность — параметры, в исследованиях обычно не достижимые.

Рисунок 2. Даже при специфичности диагностики 98% число ложноположительных диагнозов относительно редких заболеваний будет значительным по абсолютному количеству обследуемых. Такие люди, в действительности не имеющие этой болезни, пройдут дорогое и травматичное обследование.

иллюстрация Алены Беляковой

Напрашивается вывод: чтобы омикс-тест был пригоден для ранней диагностики заболевания, требуется выполнение нескольких условий (рис. 3). Во-первых, в случае 100% специфичности ДЦПР автоматически достигнет 100% (см. формулу выше). Это возможно в том случае, когда биомаркер или определенное сочетание биомаркеров выявляется исключительно при патологии, но не в норме, то есть действует качественный принцип «есть или нет». Примером могут служить соматические мутации-водители, возникающие в геноме злокачественной опухоли [16]. Вероятность встретить их в герминативном геноме взрослого человека, не имеющего злокачественной опухоли, исчезающе мала. Если омикс-тесты предполагают обнаружение рака с помощью выявления мутантных последовательностей ДНК, РНК и белка в любом биологическом материале, у этих тестов есть шанс на использование для ранней диагностики.

Рисунок 3. Выбор стратегии клинического исследования для разработки омикс-теста. Представлены условия, которые должны быть выполнены, чтобы тест подходил для ранней диагностики. Клинические потребности управляют дизайном исследования: в зависимости от задачи следует выбирать разные когорты обследуемых.

иллюстрация Алены Беляковой

Другим примером веществ, выявление которых претендует на 100-процентную диагностическую специфичность, служат онкометаболиты, синтезирующиеся исключительно в опухолевых клетках из-за мутаций, модифицирующих активность ферментов [17]. Не стоит забывать, что при абсолютной специфичности тест должен сохранять приемлемую диагностическую чувствительность. Отметим, что к сегодняшнему дню до выхода в практику дошли тесты, основанные преимущественно на мутантной опухолевой ДНК. В них также могут анализироваться участки генома с характерным для опухолей гиперметилированием оснований [18]. При этом явлении «отменяется» транскрипция генов-онкосупрессоров.

Например, с некоторыми оговорками скрининговым тестом для колоректального рака можно признать разрешенный к использованию в США тест для анализа кала Cologuard [19]. Этот тест мультиплексный и к тому же сочетает использование различных методов детекции разных молекулярных событий. Он предполагает количественное измерение ДНК с мутацией в гене KRAS, оценку аномального метилирования генов NDRG4, BMP3 и β-актина, а также иммунный анализ на гемоглобин.

Если специфичность теста не абсолютна, его всё же можно использовать для скрининга состояний, более распространенных, чем злокачественные опухоли. Однако высокие показатели заболеваемости характерны для инфекций, принципы диагностики которых обычно хорошо определены и отличаются от омиксных.

В клинике используют ряд биомаркеров для диагностики злокачественных опухолей, которые иногда позиционируют как скрининговые. В таком качестве выступали, например, различные формы простатоспецифического антигена (ПСА), измеряемые в плазме крови, и другие «раковые антигены» (cancer antigens, CA), обнаруженные в 80-е годы прошлого века иммунологическими методами. Однако диагностические характеристики этих молекул таковы, что сегодня они не прошли бы регулирующие инстанции по большинству показаний, по которым их использовали ранее. Поэтому медицинские сообщества в подавляющем большинстве случаев уже не прибегают к оценке «старых» онкомаркеров для ранней диагностики. Например, анализ уровня ПСА теперь не рекомендуют для широкого скрининга рака простаты [20]. Ведущую роль в ранней диагностике многих опухолей играют методы визуализации [21] и другие подходы, в том числе определение врачом сочетаний симптомов.

Особые указания по применению препарата Омикс

С осторожностью применяют при склонности к ортостатической гипотензии, выраженных нарушениях функции печени и клиренсе креатинина ≤10 мл/мин. При появлении признаков ортостатической гипотензии (головокружение, слабость) больного рекомендуется усадить или уложить. Перед началом лечения необходимо верифицировать диагноз. Следует соблюдать осторожность при управлении транспортными средствами и выполнении работ, требующих высокой концентрации внимания (в связи с возможным развитием головокружения).

Омикс-тесты: от ранней диагностики к оценке рисков

В большинстве случаев панели постгеномных биомаркеров дают результаты, которые не позволяют использовать их для ранней диагностики заболеваний. Однако в медицине есть большая сфера, которая крайне нуждается в разработке и использовании биомаркеров. Речь идет о прогностических и предиктивных биомаркерах, приобретающих ценность уже после постановки диагноза [22]. Без таких маркеров сложно представить персонализированную медицину, которая предполагает разделение пациентов с одним диагнозом на группы и рациональный выбор для них разных видов профилактики и лечения [23], [24]. Несмотря на смысловое сходство упомянутых терминов, они служат для различения биомаркеров, прогнозирующих тяжесть заболевания и вероятность рецидива (прогностические), и биомаркеров, предсказывающих ответ на терапию (предиктивные).

Показательна история первых протеомных биомаркеров. В начале 2000-х годов для классификации образцов плазмы крови предложили использовать масс-спектры почти необработанной плазмы, полученные с помощью прямой MALDI-TOF-масс-спектрометрии [25]. Например, в исследовании, в котором я принимал участие в уже далеком 2005 году, сравнивали масс-спектры образцов от здоровых людей и от пациентов с раком яичников [26]. Скоро стало ясно, что, хотя такой анализ и способен распознавать заболевание, его характеристики не подходят для ранней диагностики. Поэтому рассматривать тесты такого рода как скрининговые перестали. Подход справедливо критиковали за работу в формате штрихкода, без идентификации компонентов диагностического профиля, а когда их всё же идентифицировали, они оказались в основном белками неспецифического воспалительного ответа с высокой концентрацией в крови.

Подробно о масс-спектрометрии рассказывает одна из статей нашего спецпроекта «12 биологических методов в картинках» — «Протеомика» [2]. — Ред.

Одна из американских компаний, которой принадлежали патенты на некоторые компоненты масс-спектрометрических профилей плазмы крови при раке яичников, сместила акценты разработок в сторону прогностического теста. Находки, сделанные при помощи MALDI-TOF-профилей, легли в основу разрешенного к использованию теста OVA1, определяющего уровни воспалительных белов и «старого» маркера CA-125 [27]. Такой тест ни в коем случае не рассматривается как скрининговый, а предсказывает риск злокачественности опухоли у пациенток с ранее выявленными (например, в ходе ультразвукового обследования) образованиями в малом тазу. Разумеется, речи о том, чтобы разделять с помощью этого теста больных и здоровых людей, нет. OVA1 помогает определить объем оперативного вмешательства и стратегию лечения. Этот тест не стал незаменимым на рынке из-за открытия уже биохимическими, а не протеомными методами, конкурентного биомаркера — белка HE4 [28]. В сочетании с СА-125 он выполняет аналогичные тесту OVA1 функции в составе дуплексного теста с оригинальным алгоритмом оценки риска ROMA [29]. Этот тест доступен и российским пациентам.

Биомаркеры: термины

Биомаркер природная характеристика, в том числе молекула или ген, с помощью которой можно определить конкретное патологическое или нормальное, но измененное состояние организма. Диагностический биомаркер используется для установления диагноза, то есть для обнаружения заболевания или точного определения его отдельной, самостоятельной (нозологической) формы. Прогностический биомаркер используется для прогнозирования развития заболевания в будущем или характера течения уже развившегося недуга. Предиктивный биомаркер используется для предсказания ответа пациента на определенное лечение. Скрининг в медицине — обследование с помощью диагностического теста или метода большого количества людей, у которых нет признаков заболевания. Скрининг нужен, чтобы выявить болезнь как можно раньше, в бессимптомной форме. Известным примером скрининга туберкулеза служат туберкулиновая проба (пресловутая реакция Манту) и флюорография грудной клетки.
Число выполняемых в нашей стране проектов по созданию диагностических омикс-тестов, как представляется по заявкам, подаваемым в российские научные фонды, растет. Ими нередко управляют специалисты, отвечающие за сложную технологию, то есть физики, химики или биологи, которым помогают врачи. К сожалению, в ряде таких проектов, несмотря на огромные усилия, связанные с технической частью работы, современные приборы и реагенты, бывает некорректно и поверхностно поставлена клиническая задача, которая может оказаться заведомо невыполнимой. Например, для создания диагностического омикс-теста выбирают те опухоли, ранняя диагностика которых уже на достаточном уровне достижима методами визуализации.

В этой статье, где я упоминаю некоторые эпизоды из развития научного направления, в котором участвовал [26], [30], [31], хочется призвать сообщество, занимающееся постгеномными технологиями, эффективно контактировать с просвещенными клиницистами для постановки правильных, современных медицинских задач. Диагностические параметры омикс-анализов, обсуждаемые в этой работе применительно к злокачественным опухолям, относятся к любым неинфекционным заболеваниям, при диагностике которых имеет смысл применять молекулярные тесты. Во многих случаях адекватно поставленные задачи омикс-технологий, в особенности протеомики и метаболомики, связаны с разделением пациентов с уже поставленным диагнозом на группы для более корректного управления заболеванием, оценки рисков и назначения эффективной терапии.