Streptococcus pyogenes, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Исследование для выявления возбудителя стрептококковой инфекции (Streptococcus pyogenes), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени определяется генетический материал (ДНК) стрептококка в образце биоматериала.

Синонимы русские

Пиогенный стрептококк, бета-гемолитический стрептококк группы А, БГСА, β-гемолитический стрептококк группы А, β-ГСА [полимеразная цепная реакция в реальном времени, ПЦР в реальном времени].

Синонимы английские

S. pyogenes, Group A streptococcus, GAS, β-hemolytic streptococcus group A, β-hemolytic streptococcus group A.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева (ротоглотки), мазок из носоглотки, соскоб урогенитальный.

Общая информация об исследовании

S. pyogenes – это грамположительная бактерия шаровидной формы, являющаяся возбудителем острого фарингита и импетиго, а также спектра более тяжелых деструктивных заболеваний, таких как пневмония, сепсис и септический артрит, синдром токсического шока, целлюлит и некротизирующий фасциит.

Традиционно для подтверждения диагноза «стрептококковая инфекция» применяют бактериологический посев биоматериала на специальные среды. В качестве биоматериала может выступать отделяемое миндалин или носоглотки (при подозрении на острый фарингит), мокрота (при пневмонии). Как правило, результат может быть получен лишь через несколько суток, что связано с промедлением в постановке точного диагноза и назначении специфического лечения. Однако выявлено, что своевременная диагностика и специфическое лечение не только уменьшают продолжительность болезни и интенсивность симптомов, но также снижают риск развития таких осложнений, как паратонзиллярный абсцесс, средний отит, острая ревматическая лихорадка и постстрептококковый гломерулонефрит (при остром фарингите), стрептококковый сепсис (при пневмонии), деструкция сустава и инвалидизация (при септическом артрите). Эмпирическая терапия антибиотиками пенициллинового ряда основана на предпосылке, что S. pyogenes является основным бактериальным возбудителем острого фарингита (5-15 % случаев у взрослых и 20-30 % у детей). Следует отметить, что острый фарингит может быть вызван другими бактериальными или вирусными агентами, при которых назначение такой эмпирической терапии не только не оправдано, но и опасно развитием резистентных штаммов микроорганизмов. Подобные диагностические трудности могут быть преодолены с помощью РТ-ПЦР – полимеразной цепной реакции – этот метод позволяет получить точный результат в более короткие сроки.

В реакции РТ-ПЦР применяются специфические праймеры к фрагменту ДНК S. pyogenes. Такая особенность позволяет выявлять только пиогенный стрептококк, а не родственные ему другие стрептококки – представители нормальной микрофлоры зева (Streptococcus mutans, Streptococcus viridians). По специфичности РТ-ПЦР не уступает бактериологическому посеву и значительно превосходит другие методы идентификации возбудителя (например, экспресс-тест для определения антигена).

Достаточно часто биоматериал на исследование берется уже на фоне лечения заболевания. В результате чувствительность методов диагностики снижается и вероятность получить ложноотрицательный результат выше. В такой ситуации метод РТ-ПЦР обладает некоторым преимуществом перед другими видами диагностики. Это объясняется тем, что для идентификации возбудителя в реакции используется генетический материал возбудителя – как геномная ДНК живого микроорганизма, так и фрагменты ДНК бактерии, подвергшейся лизису. При этом становится возможным выявление не только живых, активно размножающихся микроорганизмов, но и убитых в результате лечения бактерий. В отличие от РТ-ПЦР, обязательным условием для осуществления других методов диагностики (иммуноферментного анализа или бактериологического посева) является наличие живых микроорганизмов. Поэтому, если биоматериал сдается уже на фоне лечения, метод РТ-ПЦР следует предпочесть другим методам диагностики.

Высокая чувствительность РТ-ПЦР позволяет использовать этот метод при диагностике осложнений острого фарингита: острой ревматической лихорадки и постстрептококкового гломерулонефрита. Осложнения острого фарингита – это аутоиммунные заболевания, при которых S. pyogenes – ассоциированный фарингит является причинным фактором патологического иммунного ответа, но на момент диагностики этих осложнений он уже проходит (самостоятельно или в результате лечения). Поэтому выявить возбудитель при бактериологическом посеве отделяемого миндалин и носоглотки у пациентов с осложнениями острого фарингита удается лишь в небольшом проценте случаев. С другой стороны, доказательство перенесенной S. pyogenes – инфекции является необходимым критерием постановки диагноза, а также значительно облегчает проведение дифференциальной диагностики заболеваний. Метод РТ-ПЦР характеризуется высокой чувствительностью и поэтому может быть использован при диагностике осложнений острого фарингита.

Выявление S. pyogenes в так называемых стерильных средах – это всегда патологический признак. С другой стороны, обнаружение этого микроорганизма в нестерильных средах (мокрота, отделяемое носоглотки) не всегда указывает на наличие заболевания. Выявлено, что около 12-20 % детей школьного возраста и 2,4-3,7 % взрослых людей являются бессимптомными носителями S. pyogenes. В таких случаях трактовку положительного результата исследования следует расценивать с учетом бактериальной нагрузки и в сочетании с некоторыми другими клиническими и лабораторными признаками. Как правило, бессимптомное носительство характеризуется меньшим количеством бактерий по сравнению с активной инфекцией. Поэтому обнаружение высокой бактериальной нагрузки S. pyogenes в мазке из зева у пациента с лихорадкой, болью в горле и болезненным регионарным лимфаденитом подтверждает диагноз «острый стрептококковый фарингит». И, наоборот, обнаружение низкой бактериальной нагрузки этого микроорганизма в мазке из зева при отсутствии жалоб и клинической картины следует расценить как бессимптомное носительство. РТ-ПЦР – это полуколичественный метод, позволяющий косвенно оценить бактериальную нагрузку. Поэтому он оказывается особенно полезным при обследовании «здоровых носителей» стрептококка. Бессимптомное носительство S. pyogenes следует заподозрить у пациента при выявлении стрептококка после адекватного курса антибиотикотерапии, а также у членов семьи пациента с частыми обострениями стрептококкового фарингита.

Для чего используется исследование?

Для диагностики:

острого фарингита;
острой ревматической лихорадки и постстрептококкового фарингита у пациентов с указанием на перенесенный эпизод острого фарингита в анамнезе или без него;
бессимптомного носительства S. pyogenes у пациента с частыми рецидивами фарингита;
бессимптомного носительства S. pyogenes у членов семьи пациента с частыми рецидивами стрептококкового фарингита;
внебольничной пневмонии;
септического артрита.

Когда назначается исследование?

При симптомах острого фарингита: боль при глотании, отек и эритема слизистой зева, гнойное отделяемое с поверхности миндалин, болезненный регионарный лимфаденит;
при симптомах острой ревматической лихорадки: мигрирующий полиартрит или артралгия, чувство перебоев в работе сердца, боль в области сердца, немотивированная слабость, кольцевидная эритема и подкожные узелки, а также неврологическая симптоматика в виде хореического гиперкинеза;
при симптомах постстрептококкового гломерулонефрита: отек (периорбитальной области или генерализованный), макрогематурия, немотивированная слабость, протеинурия менее 3,5 г/сут., артериальная гипертензия;
при обследовании пациента с рецидивирующим фарингитом;
при обследовании членов семьи пациента с рецидивирующим фарингитом;
при обследовании членов семьи пациента с частыми рецидивами острого стрептококкового фарингита;
при наличии такого фактора риска S. pyogenes (ассоциированной пневмонии), как вирус гриппа H1N1;
при симптомах внебольничной пневмонии: внезапное начало болезни, лихорадка, одышка, боль в грудной клетке, кашель с отхождением гнойной мокроты;
при наличии факторов риска септического артрита: младенческий и старческий возраст, иммуносупрессивная терапия, соматические заболевания, гемодиализ;
при симптомах септического артрита: боли в суставе в покое и при движении, эритема кожных покровов над областью сустава, нарушение подвижности в суставе, повышение температуры тела и немотивированная слабость.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата

В отделяемом носоглотки и миндалин:

острый фарингит;
острая ревматическая лихорадка;
постстрептококковый гломерулонефрит.

В мокроте:

пневмония;
острый бронхит, бронхит курильщика.

Что может влиять на результат?

Применение антибактериальных препаратов пенициллинового ряда (амоксиклав, ампициллин), цефалоспоринов (цефиксим, цефтибутен) и макролидов (азитромицин, кларитромицин) до взятия материала на анализ может привести к получению отрицательного результата.

Инфекция, вызываемая Streptococcus agalactiae (стрептококки группы В)

Стрептококки серогруппы В (СГВ) давно известны как возбудители мастита крупного и мелкого рогатого скота и получили название Streptococcus agalactiae. Ранее, до 1937 г. включительно, этот микроорганизм рассматривался как комменсал организма человека. С 60-х годов этот вид, как патоген человека, изредка начали выделять при самых различных нозологических формах инфекции: эндокардите, пиелонефрите, менингите, пневмониях, абсцессе, перитоните, родовом сепсисе, сепсисе новорожденных, фарингите и т.д. В течение 1970–1980 гг. СГВ становится одним из частых возбудителей гнойно-септических инфекций у новорожденных и матерей в США и Западной Европе. В начале 90-х годов в нашей стране также появляются первые публикации о роли этого вида стрептококка в патологии беременности и при гнойно-воспалительных заболеваниях новорожденных. До настоящего времени официальной регистрации заболеваний вызываемых этим микроорганизмом в Российской Федерации не проводится.

Стрептококки этого вида, согласно современной номенклатуре по определителю Bergay, входят в род Streptococcus семейства Sreptococcaeae, вид S.agalactiae. В основе современной классификации стрептококков лежит деление на серологические группы по классификации Ленсфильд. S.agalactiae отнесены к серогруппе В и являются ее единственными представителями. СГВ – неоднородная популяция, состоящая из ряда серотипов и их сочетаний. В настоящее время выделено 9 серотипов, обозначаемых римскими цифрами: I, II, III ,IV, V, VI, VII, VIII. Тип I разделен на подтипы Ia и Ib.

Место обитания патогена – организм человека, крупный и мелкий рогатый скот, возможность передачи его от животных к человеку и наоборот не доказана. Локализация СГВ у человека – ЖКТ (толстая кишка), влагалище, уретра, иногда микроорганизм может колонизировать зев. Факторы патогенности: способность к адгезии и инвазии, устойчивость к фагоцитозу, гемолизин, гиалуронидаза, пептидаза (нарушает хемотаксис полиморфноядерных лейкоцитов к месту инфекции СГВ).

СГВ могут вызывать у людей тяжелые инфекции. Наиболее чувствительны к ним новорожденные, беременные женщины, больные диабетом, хронические больные, дети с дистрофией, пожилые люди, лица с пониженным иммунитетом. С СГВ могут быть связаны самопроизвольные аборты, преждевременные роды, хориоамниониты, пиелонефриты, инфекции мочеполовых путей, эндокардит, сепсис, а также осложнения после кесарева сечения, менингиты, маститы и эндометриты у родильниц. У новорожденных детей СГВ в основном вызывает сепсис, менингит и пневмонию. Передача возбудителя новорожденному может происходить интранатально и постнатально. По данным зарубежных источников в последние годы отмечается относительный рост числа заболеваний, вызываемых СГВ у пожилых лиц на фоне некоторого снижения заболеваемости среди новорожденных детей. Наблюдаемое явление связывают, c одной стороны, с активной профилактикой этой инфекции в родильных домах, а с другой, с увеличением числа пациентов пожилого возраста со сниженным иммунитетом. У последних СГВ обычно вызывают инфекцию кожи и костей, сепсис без явного источника его происхождения, уросепсис, пневмонию и перетониты. Нередко перечисленные инфекции возникают у таких пациентов повторно.

Важную роль в развитии СГВ инфекций у новорожденных детей играют факторы, предрасполагающие к заболеванию, так называемые “факторы риска”, которые условно можно разделить на две группы:

cвязанные с особенностями родов или колонизацией СГВ матерей;
имеющие непосредственное отношение к новорожденным.

К первой группе можно отнести присутствие СГВ на слизистой шейки матки у беременных женщин, массивность колонизации (выделения патогена одновременно из нескольких обследованных локусов), случаи СГВ инфекций детей в анамнезе у рожениц, преждевременные роды, длительный безводный период, подъем температуры во время родов, хориоамнионит, бактериурия, обусловленная СГВ.

Ко второй группе – факт и массивность колонизации новорожденных СГВ, недоношенность и малый вес при рождении, рождение посредством кесарева сечения, внутриутробное инструментальное исследование плода, длящееся более 12 часов.

Пенициллин по-прежнему остается наиболее эффективным и распространенным препаратом для лечения инфекций вызываемых стрептококками. Наряду со стрептококками серогруппы А, СГВ сохраняют свою чувствительность к данному антибиотику, хотя у штаммов СГВ в незначительном числе случаев отмечается устойчивость к пенициллину G. Помимо пенициллина, у стрептококков выявлена высокая чувствительность к ампициллину, эритромицину, клиндамицину, линкомицину, оксациллину и меропонему. Первые три поколения цефалоспринов за исключением цефокситина и моксалактама обладают более широким спектром активности по сравнению с пенициллином. Отмечена также высокая чувствительность СГВ к ряду сравнительно новых препаратов с широким спектром активности: тиенамицину, мезлоциллину, азлоциллину и пиперациллину. У штаммов СГВ установлена частая устойчивость к аминогликозам, налидиксовой кислоте, тетрациклину, хлорамфениколу, бацитрацину, триметоприму и метромнидазолу. Тем не менее при сочетанном применении аминогликозидов с пенициллином или ампициллином в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных выявлен синергетический эффект таких комбинаций. В последние годы в зарубежной литературе появляются сообщения о выделении штаммов СГВ устойчивых к бета-лактамным антибиотикам. Природу этого явления связывают с появлением в клетках микроорганизмов генов ответственных за синтез пенициллин связывающих белков (ПСБ). По данным ряда зарубежных исследователей число штаммов СГВ резистентных к эритромицину может колебаться от 5,9 до 32,0% и число штаммов устойчивых к клиндамицину от 6,9 до 14,3%. Применение лечебных бактериофагов для профилактики и лечения СГВ инфекции в настоящее время невозможно из-за отсутствия активных специфических бактериофагов.

Показания к обследованию.

Рождение ребенка с СГВ–инфекцией в анамнезе у роженицы, СГВ–бактериурия во время данной беременности, угроза преждевременных родов, подъем температуры во время родов (≥ 38°C), безводный период продолжительностью более 18 ч.

Материал для исследования.

Кровь, СМЖ, мокрота, плодная жидкость, суставная жидкость, фрагменты пораженных тканей, мазки из ротоглотки, мазки/соскобы со слизистой влагалища, ректальные мазки.

Этиологическая диагностика включает

выделение возбудителя и выявление его ДНК.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики.

Выделение возбудителя в диагностике СГВ–инфекций является “золотым стандартом” и представляет собой важный этап в ряду диагностических мероприятий. Применяется стандартное культуральное исследование с использованием, например, 5% кровяного агара. Своевременное выделение возбудителя с определением чувствительности к антибиотикам во многом определяет эффективность лечения и профилактики данного заболевания.

При подозрении на инфекцию исследуют разнообразный биологический материал. В случае определения носительства СГВ у беременных женщин исследуются мазки со слизистой влагалища и прямой кишки на 35–37 нед. беременности. Если нет возможности провести посев сразу, возможно использование транспортных сред. Время необходимое для выделения и идентификации СГВ обычно составляет от 4 до 5 дней.

Выявление специфического фрагмента ДНК S.agalactiae методом ПЦР проводят при исследовании различного биологического материала. Соскобы эпителиальных клеток с боковых стенок влагалища, перианальные мазки на 34–36 неделях беременности исследуют для выявления колонизации влагалища и/или прямой кишки S.agalactiae; кровь, СМЖ новорожденного – для диагностики септических состояний; мазки из ротоглотки – у новорожденных с клиническими симптомами пневмонии для подтверждения диагноза. Преимуществом данного исследования является то, что оно позволяет выполнить тестирование в течение нескольких часов и тем самым ускорить принятие клинических решений по профилактике и лечению заболевания. Диагностическая чувствительность исследования составляет 81%, диагностическая специфичность – 97,6%. Выявление ДНК S.agalactiae методом ПЦР могут быть выполнены в качественном и количественном формате. Количественный формат теста позволяет использовать исследование для оценки степени колонизации СГВ выбранного локуса. Однако выявление специфического фрагмента ДНК S.agalactiae методом ПЦР не позволяет выявить жизнеспособные микроорганизмы и соответственно определить у них чувствительность к антибиотикам.