Клиническая фармакология: антиретровирусные препараты

Первые антиретровирусные препараты — нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы — были лишь частично эффективны в отношении вируса иммунодефицита человека. Только с появлением следующего класса, ингибиторов протеазы, удалось достичь контроля над заболеванием и резко снизить смертность. Им, а также ингибиторам ещё одного жизненно важного для лечения ВИЧ фермента — интегразы, и посвящена наша следующая статья из цикла об антиретровирусных препаратах.

Ингибиторы протеазы: механизм действия

Внедрение в клиническую практику ингибиторов протеазы стало краеугольным камнем лечения ВИЧ. Их добавление в схему терапии к двум нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ) позволило уменьшить количество пациентов с прогрессирующим течением заболевания (до развития СПИДа или смерти) в два раза. У 90 % пациентов, получавших комбинацию из трёх препаратов, число частиц РНК ВИЧ в крови снизилось с более чем 20 000 на миллилитр до менее чем 500 на миллилитр за 24 недели терапии [1].

Механизм действия ингибиторов протеазы основан на их способности блокировать один из ферментов, служащих важным элементом созревания вируса в жизненном цикле ВИЧ. Геном ВИЧ кодирует длинный полипептид. После удаления оболочки вируса и обратной транскрипции генома РНК образуется полипептид, содержащий все продукты вирусных генов, включая структурные белки и ферменты. Затем протеаза ВИЧ расщепляет его на составляющие вирусные белки. При подавлении активности протеазы этот процесс блокируется, что приводит к нарушению созревания вирусной мРНК, в результате чего образуются вирусные частицы, не способные заражать новые клетки [1].

Первыми ингибиторами протеазы стали пептидомиметические молекулы, схожие с пептидом-предшественником и конкурирующие с ним. Однако, как и большинство пептидомиметических белков, ранние ингибиторы протеазы имели существенный фармакокинетический недостаток: они плохо всасывались и быстро выводились при пероральном приёме. Проблема была решена заменой участка пиридина в структуре ингибиторов протеазы на тиазол, менее богатый электронами. Благодаря этому удалось повысить метаболическую стабильность молекулы и улучшить растворимость вещества в воде, а также увеличить его эффективность в отношении вируса [1, 2].

Первым ингибитором протеазы, одобренным американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) стал саквинавир — он получил «зелёный свет» всего через 97 дней после того, как была подана соответствующая заявка. В течение следующих нескольких месяцев было получено разрешение на продажу двух других ингибиторов протеаз — ритонавира и индинавира. Сегодня одобрение регулятора имеют десять препаратов этого класса: ампренавир, атазанавир, лопиновир, ритонавир, типранавир, нелфинавир, индинавир, саквинавир, фосампренавир и дарунавир.

В поисках лекарства от COVID-19

Недавно компания Pfizer рассказала о разработанном лекарстве против SARS-CoV-2. Это не первый препарат против COVID-19 — в данном вопросе передовой оказалась компания Merck со своей разработкой.

И все же, подобное событие подтолкнуло к очевидным вопросам. Каковы механизмы работы средств против коронавирусной инфекции? Чем принципиально отличаются друг от друга разные препараты? Какие из существующих решений более эффективны? Можно ли заменить вакцины лекарствами?

Ответы на все эти вопросы — в нашей сегодняшней статье. Ее мы подготовили совместно с авторами научно-популярного телеграм-канала БиоЛогика.

Существует два принципиальных способа лечения коронавирусной инфекции: облегчение симптомов при тяжелом течении заболевания и прицельная терапия, направленная на вирус. В данной статье мы остановимся на втором подходе, однако стоит сказать пару слов о симптоматическом лечении.

COVID-19 начинается с размножения вируса в организме человека: симптомы вызываются вирусными частицами. На более поздних и тяжелых стадиях основная опасность — это гипервоспаление, вызванное слишком сильной активностью иммунной системы организма []. Цитокиновый шторм — главная причина проблем при тяжелом течении COVID-19: состояние организма ухудшается из-за механизма положительной обратной связи [].

Чтобы «усмирить» иммунную систему, уже давно применяются разные неспецифичные иммуносупрессоры: дексаметазон и другие глюкокортикостероиды []. Позднее стали появляться более специфичные методики для предотвращения цитокинового шторма. Можно блокировать реакцию клеток на разные воспалительные сигналы. Тогда цитокины будут выделяться, но клетки будут менее активно на них реагировать, а положительная обратная связь будет ослаблена. По такому принципу работают ингибиторы определенных янус-киназ. Янус-киназы — это ферменты, участвующие во многих сигнальных каскадах, в том числе и в воспалительных. Среди ингибиторов янус-киназ — тофацитиниб, руксолитиниб и другие препараты [].

Есть и классический, этиотропный способ лечения — воздействие на сам вирус, а не на иммунную систему. Недостаток этих препаратов при COVID-19 — применение эффективно только в самом начале развития болезни. На более поздних стадиях сам вирус уже не имеет ключевого значения: проблема кроется в иммунной системе. Если предотвратить размножение вируса, это позволит перенести коронавирусную инфекцию в легкой форме или практически бессимптомно. Коронавирус не запустит опасные иммунные реакции в организме, в итоге можно значительно снизить уровень летальности.

Чтобы эти лекарства работали, необходимо своевременное и массовое тестирование людей с любыми легкими симптомами. Каждому должны быть доступны экспресс-тесты, основанные на выявлении коронавирусных антигенов в слизистой. В России таких тестов проводится мало, поэтому перспективы применения подобных препаратов в нашей стране достаточно туманны.

Использование аналогов нуклеотидов — это старый проверенный способ лечения вирусных заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса, вирусом Эбола, ВИЧ и других.

Еще в декабре 2021 в Nature Microbiology было опубликовано исследование о том, что вещество под названием MK-4482, химически напоминающее нуклеозид цитидин, эффективно против COVID-19 []. Было показано, что его можно применять перорально в форме таблеток, что просто и удобно. Как соединение препятствует развитию болезни? Нуклеозиды — это основной «строительный материал» нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), они необходимы вирусу для репликации, поэтому MK-4482 вызывает различные проблемы при размножении вируса.

Действующее вещество проникает в зараженную клетку. Там препарат превращается в аналог нуклеотида: ведь для репликации вирус использует именно нуклеотиды, а нуклеозиды — это их предшественники. РНК-полимераза вируса — белок, отвечающий за репликацию, принимает эту молекулу за обычный нуклеотид. Репликация нарушается. Как это сказывается на SARS-CoV-2?

Во-первых, вставка «неправильного» нуклеотида может вызвать мутацию. Во-вторых, РНК-полимераза может ингибироваться или останавливаться: вирус не может размножаться. Вещество MK-4482 работает за счет первого механизма: вызывает многочисленные мутации вируса, препятствуя его размножению и эволюции. Биологи обманывают коронавирус, подсовывая его полимеразе фальшивые нуклеотиды.

Рисунок 1 | Принцип действия лекарств, похожих на нуклеотиды или нуклеозиды

Адаптировано из статьи “Identifying mechanism for a new class of antiviral drugs could hasten approval”, 2021 [].

Именно так работает лекарство, разработанное компанией Merck: препарат вызывает мутации в размножающемся SARS-CoV-2. Как заявляет компания, их препарат на 50 % снижает риск госпитализации больных коронавирусом, однако клинические испытания еще не закончены, поэтому окончательных выводов об эффективности и безопасности лекарства пока сделать нельзя. Потенциальный риск подобных препаратов — повышенная скорость появления новых штаммов, если лекарство используется неправильно и мутагенез недостаточно сильный, чтобы уничтожить популяцию вируса [].

Препарат от Pfizer имеет принципиально иной механизм работы: главное действующее вещество является ингибитором вирусных протеаз, препятствуя размножению коронавируса. Как же это работает?

При сборке капсида — белковой оболочки вируса — коронавирус сначала синтезирует одну длинную полипептидную цепь, а затем разрезает ее с помощью протеаз. Получается несколько готовых белков []. Когда работа протеаз заблокирована, вирусные частицы не собираются, и вирус перестает размножаться. По такому принципу работают некоторые препараты от ВИЧ.

Одно из первых исследований о применении таких препаратов было опубликовано в августе 2021. Ремдесивир, EIDD-2801 и другие оказались эффективны против разных коронавирусов, в том числе и против SARS-CoV-2 [].

Лекарство от Pfizer состоит из ингибитора вирусной протеазы PF-07321332 и вспомогательного вещества — ритонавира. Изначально ритонавир был открыт как ингибитор протеазы, но другого вируса — ВИЧ. В данном случае ритонавир повышает эффективность основного препарата: он преимущественно ингибирует цитохром печени Р450 — CY3А4, который метаболизирует основной компонент лекарства — PF-07321332. Цитохромы P450 — это большая группа ферментов печени из класса монооксигеназ, участвующие в инактивации, как правило, чужеродных веществ, в том числе и лекарств. Ритонавир ослабляет работу двух изоферментов цитохрома P450 — CYP3А4 и CYP2С6, в итоге эффективность лекарства повышается.

Компания Pfizer заявляет, что их препарат снижает уровень госпитализации на 89 %, однако клинические испытания пока продолжаются. В заявлениях Merck и Pfizer речь идет о разных фазах клинических испытаний, поэтому пока сложно сказать, какое из лекарств лучше.

Еще один способ лечения ковида — использование моноклональных антител []. Ученые выделяют антитела у людей, переболевших коронавирусом, исследуют эти антитела и синтезируют на их основе новые.

Синтезированные в лаборатории антитела состоят из двух фрагментов. Первая часть связывается с вирусными антигенами (Fab — от англ. fragment antigen binding), а вторая распознается иммунной системой (Fc — от англ. fragment crystallizable region, или кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина). Антитело взаимодействует с вирусными частицами (опсонизация) или зараженными вирусом клетками и привлекает к этому различные компоненты иммунитета: систему комплемента, натуральных киллеров. Активируется и гуморальный ответ: дифференцировка В-лимфоцитов в плазмоциты.

Кроме того, моноклональные антитела могут нейтрализовывать вирус напрямую: они образуют «шубу» вокруг вирусных частиц, и те больше не могут взаимодействовать с человеческими клетками.

Рисунок 2 | Механизмы действия моноклональных антител

Адаптировано из обзора “Antiviral Monoclonal Antibodies: Can They Be More Than Simple Neutralizing Agents?” [].

Как и при вакцинации, антитела помогают справиться организму с инфекцией, однако в данном случае эти антитела — искусственные, а не выработанные самим организмом []. Это своего рода заместительная терапия.

Как правило, при лечении вирусов моноклональными антителами используют целые коктейли из нескольких типов антител, чтобы повысить эффективность. В случае коронавируса это бамланивимаб + этесивимаб или казиривимаб + имдевимаб. Другие антитела, например, сотровимаб, можно применять отдельно, а не в составе коктейля [].

Подавляющее большинство моноклональных антител к коронавирусу связываются со спайковым белком коронавируса — тем самым шипом, за счет которого вирус зацепляется за клетки и заражает их. Когда этот шип закрыт антителами, размножение коронавируса сильно замедляется, а иммунная система, наоборот, активируется.

Действующее вещество авифавира — фавипиравир — был открыт в Японии более пяти лет назад. Оно представляет собой производное пиразинкарбоксамида и ингибирует вирусную РНК-полимеразу, блокируя размножение разных РНК-вирусов.

Первое лекарство с фавипиравиром — это «‎Авиган», который был зарегистрирован в Японии в 2014 году в качестве препарата против гриппа. При этом применение авигана было одобрено только в «экстренных ситуациях» — против новых штаммов, когда другие средства оказались неэффективными.

В исследовании, посвященном безопасности фавипиравира, ученые делают такой вывод: в целом вещество безопасно, однако есть довольно много проблем []. Кроме того, фавипиравир противопоказан беременным [], этот препарат так и не был зарегистрирован в США. Эффективность фавипиравира против коронавируса оказалась низкой, и препарат для лечения нигде не применялся.

Разработанный в России «‎Авифавир» по сути является дженериком японского фавипиравира — действующее вещество и механизм те же. В России были проведены клинические испытания. Использование препарата признано более эффективным, чем стандартная терапия []. Однако уровень значимости показателей вирусного клиренса (p-value) в этом исследовании составлял только 0.155, что значительно больше стандартных 0.01 или 0.05. Это значит, что результаты статистически недостоверны. Тем не менее, на основании этих исследований лекарство было зарегистрировано в России и включено в рекомендации Минздрава. Другие зарегистрированные в России препараты с этим же действующим веществом — «‎Арепливир» и «‎Коронавир». Эффективность и безопасность данных лекарств также вызывают сомнения.

Один из способов борьбы с коронавирусом — это применение РНК-интерференции: взаимодействие по принципу комплементарности специальной малой интерферирующей РНК с матричной РНК целевого белка, трансляцию которого мы хотим предотвратить. Молекула miРНК (от англ. microRNA) не несет в себе информации о каких-либо белках, как матричная РНК, но может запускать расщепление матричных РНК. Этот сигнал может «выключать» синтез определенных белков. Такое выключение называют РНК-интерференцией.

Если сделать miРНК, направленную против белков вируса, то можно остановить его размножение в организме. Несмотря на то, что РНК-интерференция была открыта уже более 20 лет назад, одобренных FDA лекарств на ее основе довольно мало. Только три препарата с использованием siРНК (от англ. small interfering RNA — малые интерферирующие РНК), среди которых нет противовирусных средств, и ни одного — с miРНК []. Тем не менее, препараты, работающие по принципу РНК-интерференции могут быть действительно эффективны, так как они неплохо работают против вируса гепатита C, который имеет схожий с коронавирусом геном [].

Российские ученые из ФМБА разрабатывают подобные молекулы против коронавируса, уже были успешно проведены первые доклинические испытания []. Преимущество таких препаратов — в их высокой специфичности, ведь здесь работает принцип комплементарности нуклеотидов. Есть много проблем, которые предстоит решить: деградация миРНК в живом организме и доставка этой молекулы до клеток.

Существуют различные способы лечения коронавирусной инфекции, однако пока что клинические испытания ни одного из препаратов не завершены. Когда лекарства будут окончательно протестированы и их можно будет применять, это позволит значительно снизить уровень госпитализации и летальности от коронавируса.

Но у всех лекарств есть определенные недостатки. Во-первых, применять препараты нужно на ранней стадии заболевания. Во-вторых, их применение должно строго контролироваться специалистами, так как в случае прерывания курса раньше времени у каждого отдельного пациента повышается вероятность появления устойчивых штаммов вируса. Это явление напоминает выработку резистентности бактерий к антибиотикам. Наконец, рассмотренные препараты очень дорогие: один курс может стоить несколько тысяч долларов. Поэтому всеобщая вакцинация остается главным инструментом для борьбы с пандемией: лекарством невозможно заменить прививки.

Список литературы

1. Tay M. Z. et al. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention //Nature Reviews Immunology. – 2021. – Т. 20. – №. 6. – С. 363-374.
2. Zhang W. et al. The use of anti-inflammatory drugs in the treatment of people with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19): The Perspectives of clinical immunologists from China //Clinical immunology. – 2021. – Т. 214. – С. 108393.
3. Lu S. et al. Effectiveness and safety of glucocorticoids to treat COVID-19: a rapid review and meta-analysis //Annals of translational medicine. – 2021. – Т. 8. – №. 10.
4. COVID-19 Treatment Guidelines. Kinase Inhibitors: Janus Kinase Inhibitors and Bruton’s Tyrosine Kinase Inhibitors (covid19treatmentguidelines.nih.gov)
5. Cox R. M., Wolf J. D., Plemper R. K. Therapeutically administered ribonucleoside analogue MK-4482/EIDD-2801 blocks SARS-CoV-2 transmission in ferrets //Nature microbiology. – 2021. – Т. 6. – №. 1. – С. 11-18.
6. Identifying mechanism for a new class of antiviral drugs could hasten approval (psu.edu)
7. Yang H. et al. Design of wide-spectrum inhibitors targeting coronavirus main proteases //PLoS biology. – 2005. – Т. 3. – №. 10. – С. e324.
8. Rathnayake A. D. et al. 3C-like protease inhibitors block coronavirus replication in vitro and improve survival in MERS-CoV–infected mice //Science translational medicine. – 2021. – Т. 12. – №. 557.
9. COVID-19 Treatment Guidelines. Anti-SARS-CoV-2 Monoclonal Antibodies (covid19treatmentguidelines.nih.gov)
10. Pelegrin M., Naranjo-Gomez M., Piechaczyk M. Antiviral monoclonal antibodies: can they be more than simple neutralizing agents? //Trends in microbiology. – 2015. – Т. 23. – №. 10. – С. 653-665.
11. Pilkington V., Pepperrell T., Hill A. A review of the safety of favipiravir–a potential treatment in the COVID-19 pandemic? //Journal of virus eradication. – 2021. – Т. 6. – №. 2. – С. 45-51.
12. Shiraki K., Daikoku T. Favipiravir, an anti-influenza drug against life-threatening RNA virus infections //Pharmacology & therapeutics. – 2021. – Т. 209. – С. 107512.
13. Ivashchenko A. A. et al. AVIFAVIR for treatment of patients with moderate coronavirus disease 2021 (COVID-19): interim results of a phase II/III multicenter randomized clinical trial //Clinical Infectious Diseases. – 2021. – Т. 73. – №. 3. – С. 531-534.
14. Hum C. et al. MicroRNA mimics or inhibitors as antiviral therapeutic approaches against COVID-19 //Drugs. – 2021. – Т. 81. – №. 5. – С. 517-531.
15. Khaitov M. et al. Silencing of SARS‐CoV‐2 with modified siRNA‐peptide dendrimer formulation //Allergy. – 2021.
16. Tejero H., Montero F., Nuño J. C. Theories of lethal mutagenesis: from error catastrophe to lethal defection //Quasispecies: From Theory to Experimental Systems. – 2015. – С. 161-179.
17. Hum C. et al. MicroRNA mimics or inhibitors as antiviral therapeutic approaches against COVID-19 //Drugs. – 2021. – Т. 81. – №. 5. – С. 517-531.

Общие свойства ингибиторов протеазы

Препараты этой группы снижают концентрацию вирусной РНК, увеличивают количество белых кровяных клеток, отвечающих за реакцию иммунной системы на инфекцию (CD-4 клеток) и, в итоге, улучшают выживаемость при включении в терапию наряду с антиретровирусными препаратами других классов.

В целом ингибиторы протеазы имеют сходные терапевтические эффекты. Их активность в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2 расценивается как высокая, а устойчивость к ним развивается медленно.

Фармакокинетика

Ингибиторы протеазы интенсивно метаболизируются изоферментами системы цитохрома Р450, в частности, CYP3A4, что открывает возможности для целого ряда межлекарственных взаимодействий. Средства, индуцирующие активность ферментов Р450, например, рифампицин или экстракт зверобоя, ускоряют метаболизм ингибиторов протеазы, уменьшая их концентрацию в плазме и терапевтическую эффективность. И наоборот: препараты-ингибиторы ферментов Р450, такие как кетоконазол или циметидин, повышают уровень ингибиторов протеазы в плазме, что связано с увеличением токсичности последних [2].

На сегодня наиболее мощным ингибитором CYP3A4 является ритонавир. Он специально комбинируется с другими ингибиторами протеазы, являющимися субстратами CYP3A4 для продления их периода полувыведения [4].

Ингибиторы протеазы лучше всасываются при приёме во время или после еды [2, 3].

Показания

Препараты этого класса применяются для лечения ВИЧ-инфекции, профилактики передачи инфекции от матери к ребёнку и постконтактной профилактики заболевания.

Противопоказания

Противопоказано одновременное применение ритонавира с препаратами, выведение которых зависит от активности CYP3A4, во избежание токсичности антиретровирусной терапии.

Побочные эффекты

Неблагоприятные реакции при применении ингибиторов протеазы включают [2, 3, 4]:

• желудочно-кишечные расстройства, в частности, диарею с неустановленным механизмом, которая осложняется тем, что она нередко становится одним из осложнений ВИЧ;
• гиперлипидемию — общий побочный эффект для всех ингибиторов протеазы, реже возникает при приёме атазанавира; по всей видимости, нарушение липидного обмена связано с перераспределением жировой ткани, характерным для ВИЧ, которое обостряется при приёме ингибиторов протеазы;
• гипергликемию, инсулинорезистентность, которые развиваются, вероятно, в результате подавления ингибиторами протеаз переносчика глюкозы, что приводит к подавлению активности поглощения глюкозы клетками; с меньшей вероятностью этот побочный эффект проявляет атазанавир по сравнению с другими ингибиторами протеазы;
• сыпь, чаще всего возникает при приёме ампренавира.

Известен и ряд уникальных побочных эффектов: так, при приёме атазанавира может фиксироваться гипербилирубинемия, которая не считается признаком гепатотоксичности препарата, а на фоне применения индинавира возникает кристаллурия и нефролитиаз, что связано с плохой растворимостью препарата в воде. Поэтому пациентам, получающим индинавир, рекомендуют увеличить потребление жидкости во время лечения.

Особые указания

Использование ритонавира в качестве единственного ингибитора протеазы ограничено из‑за его выраженных пищеварительных побочных эффектов в терапевтических дозировках. Сегодня препарат применяют в низких дозах для повышения активности других ингибиторов протеаз. Одним из самых частых комбинированных препаратов, используемых для лечения ВИЧ, сегодня является лопинавир + ритонавир. Следует обратить внимание на то, что капсулы и растворы ритонавира содержат этиловый спирт, поэтому пациентам, получающим препарат, необходимо избегать приёма препаратов, вызывающих дисульфирамовую реакцию, в частности, дисульфирама и метронидазола [4].

Ингибиторы интегразы: механизм действия

Интеграза наряду с обратной транскриптазой и протеазой — один из ключевых участников репликации ВИЧ-1. Она катализирует процессы, приводящие к перемещению ДНК или её фрагментов внутри генома или между геномами. Будучи частью прединтеграционного комплекса, интеграза распознаёт длинные терминальные повторы на концах двойной цепи вновь синтезированной вирусной ДНК, отщепляет по два или по три основания с каждого конца, а также участвует в транспортировке вирусной ДНК в ядро клетки-мишени, где определяет предпочтительный сайт внедрения вирусной ДНК в хромосому и осуществляет её интеграцию в клеточный геном [5].

Ингибиторы интегразы, связываясь с её активным участком и блокируя этап переноса цепей во время интеграции ретровирусной ДНК, предотвращают образование ковалентных связей с ДНК хозяина и включение ВИЧ в геном хозяина [4].

В отличие от обратной транскриптазы и протеазы, интеграза не имеет близких аналогов в эукариотической клетке, поэтому у препаратов, избирательно действующих на неё, побочные эффекты должны быть минимальны [5].

Первым ингибитором протеазы стал ралтегравир, одобренный Администрацией по продуктам питания и лекарственным препаратам США в 2007 году [6]. Сегодня наряду с ралтегравиром используются ещё 4 препарата этого класса: элвитегравир, долутегравир, биктегравир и каботегравир. В разработке находится ещё две молекулы, одна из которых, по всей вероятности, имеет длительность действия до 4 раз больше по сравнению с ралтегравиром и, возможно, будет отнесена к ингибиторам интегразы второго поколения.

Общие свойства ингибиторов протеаз

Механизмы устойчивости к ингибиторам интегразы отличаются от таковых к другим классам антиретровирусных препаратов. Если в основе резистентности большинства ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и ингибиторов протеазы лежит изменение конфигурации активного центра фермента и следующее за ним блокирование присоединения молекулы лекарства, то в случае с ингибиторами интегразы, по всей вероятности, имеют место другие феномены, причём для разных мутаций они могут отличаться [7]. Считается, что ралтегравир имеет низкий генетический барьер для развития устойчивости, поскольку единичная точечная мутация ВИЧ может приводить к изменению способности интегразы к ингибированию. Возможно, имеет место перекрёстная резистентность между ингибиторами интегразы [4].

Фармакокинетика

Основной путь выведения ралтегравира — через печень, тем не менее коррекция дозы препарата у пациентов с печёночной недостаточностью лёгкой и средней степени тяжести не требуется. Почечное выведение играет незначительную роль в метаболизме ингибиторов протеазы, поэтому при почечной недостаточности дозу не пересматривают.

Ралтегравир не является субстратом для ферментов цитохрома CYP450, не ингибирует и не индуцирует их, с чем связана низкая частота лекарственных взаимодействий.

Показания

Ингибиторы протеазы показаны при ВИЧ-1 инфекции у пациентов, у которых выработалась устойчивость к другим классам антиретровирусных препаратов.

Противопоказания

Не имеют терапевтического значения ввиду высокого профиля безопасности препаратов.

Побочные эффекты

Поскольку антиретровирусные препараты обычно назначаются в комбинированных схемах, возникают сложности с определением неблагоприятных реакций, связанных с конкретным классом или лекарственным средством. В целом ингибиторы протеазы хорошо переносятся. В контролируемых исследованиях побочные эффекты при приёме ралтегравира были сопоставимы с таковыми при приёме плацебо. Ралтегравир считается одним из самых безопасных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции благодаря минимальному риску развития нежелательных явлений, причём как у пациентов, ранее не получавших антиретровирусную терапию, так и уже имевших опыт лечения препаратами других классов [4, 8].

Протеолитические ферменты и их белковые ингибиторы из зерна тритикале

Протеолитические ферменты играют значительную роль в различных физиологических процессах. Ключевая роль протеиназ проявляется не только в процессах деградации запасных белков, удалении «неправильных» белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза, но и участии в посттрансляционном процессинге белков, активации неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, что свидетельствует о том, что протеиназы во многих случаях являются «пусковыми механизмами» ряда каскадных процессов и выполняют различные регуляторные функции. В настоящее время установлено, что протеолитические ферменты участвуют в процессах секреции, транспорта белковых веществ через биологические мембраны, адаптации клеточного метаболизма к изменениям внешней среды, в осуществлении защитных функций (Браудо, Даниленко, Дианова, Кроха, 2000; Мосолов, 1983). Наряду с причинами физиологического характера интерес к протеолитическим ферментам обусловлен еще и тем, что они являются удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности, других важных вопросов энзимологии и белковой химии. С практической точки зрения интерес к протеолитическим ферментам связан с их непосредственным участием в процессах, протекающих при хранении и переработки растительного сырья, а также применением препаратов протеаз в различных отраслях: сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине. На современном этапе развития наших представлений о роли пищи как фактора профилактики и лечения различных хронических заболеваний многочисленные открытия в пищевых продуктах веществ, обладающих профилактическими и лечебными свойствами (нутрицевтики), предопределили пересмотр приоритетов в пищевой технологии: если традиционно основной целью питания считалось удовлетворение потребностей человека в макро- и микронутриентах, то сегодня наряду с этим пищевые технологии должны ориентироваться на сохранение нативных свойств биологически ценных компонентов, в том числе и из растительного сырья, обладающих лечебно-профилактическими свойствами. Все это в полной мере относится к технологиям получения белковых продуктов (концентратов и изолятов), которые не во всем отвечают указанной цели. Очевидно, что задача освобождения растительного сырья от нежелательных компонентов и обеспечения определенных функциональных свойств получаемых белковых продуктов сохраняет свою актуальность, однако необходим компромисс между сохранением пищевой ценности и улучшением функционально-технологических свойств растительных белковых продуктов. В связи с этим большие возможности по модификации растительного сырья, в том числе зерна и продуктов его переработки, заключены в методах пищевой биотехнологии, которые принято подразделять на три группы: первая предусматривает модификацию сырья под действием микроорганизмов, вторая использование экзогенных ферментных препаратов, третья — использование собственных ферментов, преимущественно гидролитического действия. На современном этапе наибольшее распространение получили методы ферментативной модификации зернового сырья с использованием микробных ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитичесого действия. Так, во Всероссийском НИИ зерна и продуктов его переработки — филиале «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН разработаны способы ферментативной модификации биополимеров зерна тритикале и продуктов его переработки (отруби), которые позволяют получать продукты с различной степенью гидролиза белка и некрахмальных полисахаридов, обладающих определенными функционально — технологическими свойствами, что в конечном счете позволяет предположить широкий спектр областей их возможного применения — от хлебобулочных и мучных кондитерских изделий до мясных и молочных продуктов, напитков и соков (Витол, Мелешкина, Карпиленко, 2016; Витол, Мелешкина, Карпиленко, 2017; Meleshkina, Pankratov, Vitol, Kandrokov, Tulyakov, 2017). В то же время исследованием собственных протеолитических ферментов, их выделение и очистка с целью использования для модификации эндогенных белков, к которым они проявляют наибольшее сродство, представляется весьма интересной задачей, в плане использования всего биопотенциала зерна и «экологичности» получаемых продуктов. Такое исследование неразрывно сопряжено с изучением белковых ингибиторов протеиназ, которые традиционно рассматривались лишь как антиалиментарные компоненты сырья и пищевых продуктов, но представляют исключительный интерес как фактор регуляции процесса протеолиза, не только in
vivo,
но и
invitro.
Таким образом, ферментативная модификация пищевого сырья, осуществляемая экзогенными ферментными препаратами или эндогенными ферментами может приводить к созданию продуктов с определенными функционально-технологическими свойствами и дополнительными физиологическими активностями, которые каждый раз должны быть предметом специального исследования. Цель исследования — выделение, очистка и характеристика протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов из зерна тритикале.
Материалы и методы
В работе использовали зерно тритикале урожая 2021 г., предоставленное Донским зональным научно-исследовательским институтом сельского хозяйства. Содержание растворимого белка определяли по методу Лоури, активность протеаз модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычего сывороточного альбумина. Ингибирующую активность определяли по остаточной активности протеиназ (Нечаев, Траубенберг, Кочеткова, Колпакова, Витол, Кобелева, 2006). Фракционирование ферментов и их белковых ингибиторов проводили на колонке (2,3 х 35), заполненной гелем Toyopearl HW-55F, гель этой марки позволяет разделять белки с молекулярной массой от 1000 до 700000 Да. Предварительно колонку откалибровали для определения свободного (Vcb.) и общего (Vобщ.) объема колонки. Свободный объем определяли по выходу декстрана синего (молекулярная масса около 2 млн. Да). Он составил 44 мл. Общий объем по выходу тирозина. Он составил 140 мл. Для определения молекулярной массы белков графическим методом колонку маркировали стандартными метчиками с известной молекулярной массой (Германия) (Нечаев, Траубенберг, Кочеткова, Колпакова, Витол, Кобелева, 2006).
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ имеющихся в литературе данных по выделению и очистке эндогенных протеаз зерна свидетельствует о том, что пик исследований в этой области пришелся на 70-е — 80-е годы 20-ого века. Работами отечественных и зарубежных исследователей показано наличие протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в покоящихся и прорастающих семенах зерновых (пшеница, ячмень, рожь, тритикале) (Исламов, Хакимжанов, Фурсов, 2004; Исламов, Хакимжанов, Фурсов, 2005; Meleshkina, Pankratov, Vitol, Kandrokov, Tulyakov, 2017) и бобовых культур (соя, фасоль, горох, маш, нут) (Асатулоев, Карпиленко, Витол, 2008; Мосолов, 1983). Некоторые из них выделены и очищены в достаточно высокой степени, доказана способность эндогенных протеиназ активно гидролизовать собственные белки, оказывать влияние не только на биохимические процессы при созревании и прорастании зерна, но и на процессы, связанные с деградацией белков зерна при его переработке. Выявлена регуляторная роль белковых ингибиторов в процессе протеолиза в покое и при прорастании зерна. Новый виток интереса к эндогенным протеиназам и их белковым ингибиторам связан, как уже отмечалось выше, с возможностью их использования для ферментативной модификации биополимеров зерна и зернопродуктов. Работы, проводимые во Всероссийском НИИ зерна и продуктов его переработки, показали, что в зерне тритикале наряду с кислыми протеиназами с оптимумом рН 3,5 присутствуют нейтральные и щелочные протеиназы с оптимумами рН 6,8 и 9,5 соответственно при гидролизе стандартного субстрата бычьего сывороточного альбумина (Витол, Кандроков, Стариченков, Коваль, Жильцова, 2015). Кроме того, выявлено, что активность кислых и нейтральных протеиназ в большей степени связана с белками, сосредоточенными в периферийных частях зерновки, очевидно, с белками алейронового слоя (Витол, Кандроков, Стариченков, Коваль, Жильцова, 2015). Схема выделения эндогенных протеаз в виде комплексного препарата включала следующие стадии:

• Зерно тритикале подвергалось измельчению. К измельченному материалу (100% проход сита с диаметром 1 мм) добавляли 0,3596 раствор Na2CC>3, в соотношении 1:10. Экстракцию проводили при интенсивном перемешивании на мешалке с гибким приводом при 4000 об/ мин в течение 5 мин.
• Полученную суспензию центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут. Осадок отбрасывали, надосадочную жидкость (супернатант) использовали для осаждения ферментов (протеаз).
• Осаждение проводили путем подкисления 5%
  лимонной кислотой до рН 4,5. Ранее было показано, что при таком значении рН осаждаются все протеолитические ферменты (кислые, нейтральные, щелочные).
• Формирование осадка проводили при температуре 4-6°С в течение 1 часа.
• Полученный осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут, замораживали и высушивали из замороженного состояния (лиофильная сушка), что позволило сохранить активность выделяемых ферментов.

На всех этапах выделения активность протеаз определяли модифицированным методом Ансона, в качестве субстрата использовали бычий сывороточный альбумин. В Таблице 1 приведены данные по содержанию белка, активности и степени их очистки на разных стадиях.

Данные Таблицы 1 показывают, что при осаждении нейтральных и кислых протеиназ подкислением происходит их очистка примерно в 5 — 5,5 раз. Использование метода фракционирования белков, основанное на различиях в физико-химических свойствах отдельных белков, в частности метода гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F, позволило разделить кислые, нейтральные и щелочные протеиназы зерна тритикале и определить их молекулярную массу в составе комплексного препарата. Для этого на колонку, заполненную гелем Toyopearl gel HW-55F, наносили 5 мл комплексного препарата протеиназ, перерастворенного в 0,35%-ном растворе Na2C03n сконцентрированного в 10 раз. Объем собираемых фракций составлял 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре. Профили элюции и активность протеиназ представлены на Рисунке 1.

По результатам гель-хроматографии молекулярная масса кислых протеиназ — 75000 Да, нейтральных протеиназ — 250000 Да, щелочных — 50000 Да. При этом степень очистки составила соответственно 17,03; 15,03 и 27,03 раз. Результаты исследований по характеристике очищенных препаратов протеаз из зерна тритикале суммированы в Таблице 2. Они свидетельствуют о том, что кислые и нейтральные протеиназы тритикале следует отнести к ферментам тиолового типа, поскольку они активируются цистеином и ингибируются п-хлормеркурийбензоатом (п-ХМБ) — специфическим ингибитором тиоловых ферментов; а щелочные протеиназы — к сериновым ферментам, поскольку они ингибируются специфическими ингибиторами сериновых ферментов — диизопропилфторфосфатом (ДФФ) и фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ). При этом их нельзя отнести к металлозависимым ферментам, так как этиленаминтетраацетат (ЭДТА) не оказывает влияния на их активность.

На следующем этапе работы проводили выделение и частичную очистку белковых ингибиторов эндогенных протеиназ из зерна тритикале. При разработке схемы выделения ингибиторов мы ориентировались на данные отечественных исследователей о том, что в над осадочной жидкости после экстракции водой из зерна пшеницы, ржи, сои, фасоли и осаждения протеаз при подкислении остаются белковые ингибиторы, подавляющие активность собственных протеолитических ферментов и активность трипсина (Мосолов, 1983). Аналогичные результаты были получены нами при изучении взаимодействия ингибиторов, выделенных подкислением в интервале рН от 4,5 до 3,0 с протеиназами тритикале и трипсина (Рис. 2).

При этом степень очистки белковых ингибиторов кислых и нейтральных протеиназ составила 26,6 раз; щелочных протеиназ — 25,0 раз; трипсина -21,9 раз. Выделенные таким образом белковые ингибиторы фракционировали на колонке с Toyopearl gel HW-S5F. Полученные фракции анализировали на ингибирующую активность по отношению к собственным протеиназам и трипсину (Рис. 3).

Полученные данные показывают, что ингибитор трипсина и ингибитор щелочных протеиназ выходят в одной фракции с объемом элюции 88 мл и имеет молекулярную массу 30000 ¸ 35000 Да. Ингибиторы кислых и нейтральных протеиназ по данным метода гель-хроматографии, выходят с колонки с объемом элюции 96-100 мл и имеют молекулярную массу 15000¸20000 Да. Это является дополнительным косвенным подтверждением того, что ферменты, относящиеся к одному типу (трипсин и щелочные протеиназы тритикале -сериновые ферменты; кислые и нейтральные протеиназы тритикале — тиоловые ферменты) специфически ингибируются различными ингибиторами по конкурентному механизму ингибирования, то есть в образовании комплекса фермент-ингибитор участвуют активные центры изучаемых ферментов и ингибиторов. На основании проведенных экспериментов разработана схема выделения белковых ингибиторов из зерна тритикале. Она включает следующие этапы: Экстракция измельченного материала водой в соотношении 1:10 при интенсивном перемешивании на мешалке с гибким приводом при 4000 об/мин в течение 5 мин. Центрифугирование при 6000 об/ мин в течение 10 мин. Подкисление водного экстракта до рН 4,5. Формирование осадка в течение 1 часа при температуре 4-6°С. Центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин (осадок — протеиназы; надосадочная жидкость — белковые ингибиторы). Дальнейшее подкисление надосадочной жидкости до рН 3,0. Формирование осадка в течение 1 часа при температуре 4-6°С. Центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин. Перерастворение осадка в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5. Фракционирование белковых ингибиторов методом гель-хроматографии на колонке с Toyopearl gel HW-55F. Разделение ингибиторов трипсина и щелочной протеиназы тритикале и ингибиторов кислой и нейтральной протеиназ тритикале. Заключение
В работе представлены экспериментальные данные по выделению,частичной очистке и характеристике протеолитических ферментов зерна тритикале, действующих в кислой нейтральной и щелочной областях рН. Показано, что кислые и нейтральные протеиназы зерна тритикале являются ферментами тиолового типа, поскольку активируются цистеином и ингибируются п-хлормеркурий бензоатом специфическим ингибитором тиоловых ферментов. Щелочные протеиназы относятся к сериновым протеиназам, поскольку ингибируются специфическими ингибиторами сериновых ферментов — диизопропилфторфосфатом и фенилметилсульфонилфторидом. Методом гель-хроматографии определена молекулярная масса протеиназ зерна тритикале: кислые — 75000 Да, нейтральные — 250000 Да, щелочные — 50000 Да. Предложена схема выделения и очистки белковых ингибиторов эндогенных протеиназ из зерна тритикале. Показана их способность подавлять активность собственных протеиназ и трипсина. Методом гель-хроматографии проведено разделение ингибиторов трипсина и щелочных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 30000 ¸35000 Да) и ингибиторов кислых и нейтральных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 15000¸20000 Да). Принимая во внимание все вышеперечисленное, следует отметить, что частично очищенных препараты протеиназ и их белковых ингибиторов, полученные по предложенным схемам в дальнейшем могут быть использованы для ферментативной модификации растительных белков и регуляции процессов протеолиза в различных пищевых технологиях.
Литература
1. Асатулоев И. А., Карпиленко Г. П., Витол И. С. Белковые ингибиторы протеаз из семян нута //Хлебопродукты. 2008. № 1. С. 58-59. 2. Браудо Е. Е., Даниленко А. И., Дианова В. Т., Кроха Н. Г. Альтернативные подходы к получению растительных бенковых продуктов / в кн.: Растительный белок: новые перспективы (под ред. Е.Е. Браудо). М.: Пищепромиздат, 2000. С. 6-23. 3. Витол И. С, Кандроков Р. X., Стариченков А. А., Коваль А. И., Жильцова Н. С. Белково-протеиназный комплекс зерна тритикале // Хранение и переработка сельхозсырья. 2015. № 8. С. 36-39. 4. Витол И. С, Мелешкина Е. П., Карпиленко Г. П. Биоконверсия тритикалевых отрубей с использованием ферментных препаратов целлюлолитического и протеолитического действия // Хранение и переработка сельхозсырья. 2016. № 10. С. 35-38. 5. Витол И. С, Мелешкина Е. П., Карпиленко Г. П. Функциональные свойства модифицированных продуктов переработки зерна тритикале // Хранение и переработка сельхозсырья. 2021. № 2. С. 27-29. 6. Исламов Р. А., Хакимжанов А. А., Фурсов О. В. Выделение ингибиторов сериновых протеаз и амилаз из зерна пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 2004. № 4. С. 117-122. 7. Исламов Р. А., Хакимжанов А. А., Фурсов О. В. Ингибитор трипсина из зерна пшеницы, выделенный аффинной хроматографией на трипсин-сефарозе // Биотехнология. Теория и практика. 2005. № 2. С. 71-75. 8. Meleshkina E. P., Pankratov G. N., Vitol I. S., Kandrokov R. H., Tulyakov D. G. Innovative Trends in the Development of Advanced Triticale Grain Processing Technology // Foods and Raw Materials. 2021. Vol.5. № 2. P. 70-82. DOI: 10.21179/2308-40S7-2017-2-70-82. 9. Мосолов В. В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. М.: Наука, 1983.40 с. 10. Нечаев А. П., Траубенберг С. Е., Кочеткова А. А., Колпакова В. В., Витол И. С, Кобелева И. Б. Пищевая химия. Лабораторный практикум. СПб.: ГИОРД, 2006. 304 с.

Витол Ирина Сергеевна
кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудникМелешкина Елена Павловнадоктор технических наук, директорВНИИЗ — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН
Статья опубликована в журнале: Хранение и переработка сельхозсырья (ХИПС). – 2021. — №3. – С.36-45.